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Microscopia de fluorescência

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Se entiende por fluorescência la propiedad que algunas substancias poseen, después de ser excitadas con radiação de baja largura de onda, resultando en la emisión de radiação de mayor largura de onda. Así, determinadas substancias absorben la energía de la luz ultravioleta y emiten después radiação dentro del espectro de luz visible.

Uno de los equipamientos que permite la observación de la fluorescência se denomina microscópio de fluorescência y su descubrimiento constituyó un enorme progreso en los estudios de las estructuras celulares y de sus constituyentes.

Parte integrante de esta técnica son los fluorocromos, que podrán ser conjugados con anticorpos, haciendo posible la localización e identificación de moléculas individuales que reaccionan con el anticorpo. Esta aplicación, es designada por imunofluorescência, siendo una de las más importantes en el contexto de la microscopia de fluorescência.

Archivo:Microscópio de fluorescência1.jpg
Fig.1 Microscópio de Fluorescência

Tabla de contenido

Historia

Fluorescência [1]

Su descubrimiento es atribuido a Nicolás Monardes (1577), un médico y botânico español. La descripción de la opalescência azul surgió a partir de una infusão de agua y de madera de un pequeño árbol mexicano. Sin embargo, fue Bernardino de Sahagún, un missionário franciscano, que describió esta propiedad de la madera (ya antes observada por los Aztecas).

Esta madera (Lignum Nephriticum) fue muy popular en la Europa de los siglos XVI y XVII, debido a sus propiedades medicinais en el tratamiento de las maleitas renais. El inglés John Frampton también a describió como siendo “una madera blanca que da un color azul” cuando colocada en agua.

En 1646, el padre jesuíta alemán Athanasius Kircher escribió un libro en el cual describió su observación sobre este fenómeno. Según él, la luz que atravesaba la infusão aquosa de esta madera presentaba un color amarelada, mientras la luz reflectida por esta solución presentaba un color azul.

En 1670, Robert Boyle investigó este fenómeno más profundamente, descubriendo que después de muchas infusões la madera perdía su capacidad de conferir un color al agua. Concluyó, de esta forma, que había alguna sal esencial en la madera responsable por este efecto, y que la adición de un ácido abolía el color, mientras la adición de una base permitía restaurarla. Boyle fue, así, el primero a utilizar la fluorescência como indicador de pH.

A pesar de los siglos siguientes no haber sido muy estudiada, en 1915 Safford identificó las especies que producían esta madera como Eynsemhardtia polystachia. Más recientemente, fueron aislados algunos glucosilhidroxialcanos altamente fluorescentes a partir de esta planta.

Otros estudios recientes, de Ulises Acuna, indicaron que la emisión azul original observada por los Aztecas era probablemente debida a la conversión de la coatline B, bajo condiciones ligeramente alcalinas, en un compuesto con fuerte emisión de radiação azul (con pico máximo de emisión a 466 nm), que hacía acordar la fluoresceína .

Aún el siglo XVII, en 1612, Galileu Galilei describió la emisión de luz a partir de una piedra famosa, a “Bolognian stone”fosforescência.

En 1833, David Brewster describió que cuando un feixe de luz blanca pasa a través de una solución alcoólica de hojas es observado un feixe de luz roja – fluorescência de la clorofila.

Doce años después, en 1845, John Herschel observó por primera vez la fluorescência a partir del sulfato de quinina, designando este fenómeno de dispersão epipólica. En 1852, George Gabriel Stokes denominó este mismo fenómeno de reflexión dispersiva. En su experiencia, Stokes usó un prisma para dispersão del espectro de la luz solar e iluminación de una solución de quinina. Este verificó que sólo obtenía algún efecto cuando la solución era colocada en la región ultravioleta del espectro. De esta forma, la fluorescência presenta una largura de onda superior al de la fuente de excitación (luz ultravioleta) – “desvío de Stokes”.

En 1882, Paul Erlich usó la uranina (la sal sódico de la fluoresceína) para observar la secreção del humor aquoso en el ojo. Esta fue la primera utilización in vivo de la fluorescência.

En 1887, K. Noack publicó un libro en el cual listaba 660 compuestos organizados en consonancia con el color de su fluorescência.

Diez años después, R. Meyer utilizó el término “fluoróforo” para describir los grupos químicos que se encontraban asociados a la fluorescência. Este término es análogo al término “cromóforo”, el cual fue usado por primera vez en 1876 por Lo. N. Witt para describir grupos químicos asociados al color.

Microscópio de fluorescência [1][2]

Las primeras investigaciones que dieron origen a la invención del microscópio de fluorescência se atribuyen al científico alemán August Köhler.

Köhler realizó experiencias con radiação ultravioleta que, debido a su largura de onda más corto, podrían contribuir para el incremento del poder de resolución, faz a la ya observada en la microscopia óptica. Sería a partir de estas investigaciones que surgiría el microscópio de ultravioletas (UV) (entre 1901 y 1904).

En 1904, se descubrió que el tejido demuestra fluorescência cuando irradiado por luz ultravioleta, siendo este fenómeno conocido como autofluorescência. Esta propiedad investigada en la investigación de bacterias, protozoários, plantas, tejidos animales y en varias substancias biorgânicas cómo, por ejemplo, la albumina, la elastina y la queratina.

El siglo XX, expresamente entre 1911 y 1913, Otto Heimstaedt y Heinrich Lehmann desarrollaron los primeros microscópios de fluorescência, a partir de la plantilla de microscópio de UV.

En 1914, Stanislav Von Prowazek utilizó el microscópio de fluorescência para estudiar la conexión de los corantes a la células vivas, llegando a la conclusión que secciones de tejido corados podrían ser examinados recurriendo al microscópio de fluorescência, si los corantes utilizados fueran fluorescentes. Estos corantes fueron denominados fluorocromos, de modo a los distinguís de los diacromos (tintas coloreadas que se hacen visibles por absorção de luz).

Pero, el principal factor impulsionador para la microscopia de fluorescência se debe al desarrollo de técnicas de conjugación de fluorocromos la anticorpos por Coons y sus colaboradores, en 1941. La microscopia de fluorescência suministró una mayor sensibilidad necesaria para la demostración de las reacciones anticorpo-antigénio in situ. La técnica de Coons marcaba así la génese de la Imunofluorescência.

Con estos nuevos métodos, los microscópios de fluorescência se hicieron accesibles, llevando a su utilización en varias áreas.

Evolución del microscópio de fluorescência [2][3][4][5]

La evolución tecnológica conectada al microscópio de fluorescência asume carácter multidisciplinar una vez que se cruza con la física, la óptica, la química, la ingeniería genética, la biología. Todas estas ciencias dieron una contribución fulcral para que fuera posible visualizar substancias fluorescentes acopladas la proteínas y así, aumentar la compreensão de la actividad celular.

Científicos como Wilhelm Conrad Roentgen, que venció el primer Premio Nobel de la Física, y Alexandre Edmond Becquerel, hicieron las primeras observaciones sobre la fluorescência . Antoine Henri Becquerel heredó de su padre la colección de minerais y compuestos fluorescentes que, en asociación con las conclusiones de la Roentgen, consiguió demostrar que tanto los rayos-X como la fluorescência exigen una continua fuente de energía para emitir radiação.

El principal descubrimiento, que dio renombre a la microscopia de fluorescência, se relaciona con una proteína con autofluorescência de memoria verde – Green Fluorescent Protein (GFP) – presente en organismos vivos. Fue identificada y aislada en la década de 60 por el biólogo marino Osamu Shimomura a partir de los cnidários Aequorea Victoria, siendo identificada como uno brillo verde causado por una proteína. Posteriormente, Douglas Prasher estudió el gen reportero de la GFP. La estructura de esta proteína sólo fue debidamente caracterizada en 1996 por Martin Chalfie, Roger Y. Tsien y Osamu Shimomura.

Este conocimiento fue un marco importante para la evolución del área, promoviendo una nueva clase de métodos de marcación estructuras a través de la microscopia de fluorescência.

Un elemento-llave para la evolución de la microscopia, en general, fue la transición para la imagen digital, en la década de 1990, con adquisición de instrumentos de alta sensibilidad y de ordenadores con hardware avanzado, a precios accesibles.

Los microscópios de fluorescência han evolucionado a una velocidad asombrosa al largo de la última década, aliada principalmente al rápido avance en la tecnología láser y del ordenador basado en análisis de imagen.

Contribución para el conocimiento [2][3][4][5]

La microscopia de fluorescência es una de las técnicas de imagen más utilizada para el estudio de la dinámica de células vivas, debido a su capacidad de aislar diferentes proteínas con un alto grado de especificidade, siendo su sensibilidad suficientemente elevada para detectar cerca de 50 moléculas/µm3.

La marcación de diferentes moléculas con fluorocromos distinguidos (diferentes colores), permite la evaluación simultánea de varios tipos de moléculas. La combinación de estos factores confieren a la microscopia de fluorescência una clara ventaja sobre otras técnicas observación estructural, expresamente microscopia óptica, tanto in vitro como invivo .

A través del desarrollo de sondas fluorescentes y nuevos microscópios de alta resolución, la biología de imagen entró en una nueva era y tiene, actualmente, un profundo impacto sobre la forma como la investigación es conducida en las ciencias de la vida. Los científicos tienen viniendo a depender cada vez más de la observación microscópica, siendo posible visualizar componentes y procesos subcelulares invivo , tanto al nivel estructural como funcionalmente.

Actualidad [2][3][4][5]

La importancia de la microscopia de fluorescência tuvo su reconocimiento máximo con la atribución en 2008 del Premio Nobel de la Química, concedido a los científicos que identificaron la estructura de la GFP.

Perspectivas futuras [2][3][4][5]

La investigación de métodos de procesamiento de señales biológicas es sólo el punto de partida para la evolución de esta área, siendo que aún no están claramente formuladas los campos a desarrollar.

Sin embargo, será previsible que los principales desafíos en la microscopia de fluorescência pasen por métodos más sensibles y con mayor amplificação de señal.

La necesidad de respuesta a la investigación por parte de la comunidad científica fomentará también la necesidad del fabrico de microscópios de fluorescência tecnológicamente más avanzados, así como los accesorios adecuados a los mismos, lo que constituirá una importante contribución para la investigación en el ámbito de los organismos vivos.

Constitución del microscópio [6][7][8]

En la microscopia de fluorescência, la muestra que se quiere estudiar es ella propia la fuente de luz, siendo la técnica usada para estudiar muestras que puedan emitir fluorescência.

El microscópio de fluorescência se basa en el fenómeno que cierto material emite energía detectável como luz visible cuando irradiado con luz de una largura de onda específico. La muestra puede emitir fluorescência en su forma natural, como la clorofila y algunos minerais, o a través de tratamiento con químicos fluorescentes (fluoróforos).

El microscópio de fluorescência es constituido fundamentalmente por parte mecánica, que comporta el sistema de soporte el sistema de focagem, y por parte óptica, que comporta el sistema de ampliación y el sistema de iluminación.

Sistema de soporte [8][9]

El sistema de soporte sirve para sostener en las posiciones correctas las diferentes piezas del microscópio y de él forman parte el cañón, el revólver, el brazo, la platina y la base del microscópio.

Este debe providenciar al microscópio una buena estabilidad mecánica, es decir, cualquier vibración entre la cuchilla y el cuerpo del microscópio debe ser reducida al mínimo absoluto, una vez que tal vibración puede ser aumentada por el propio factor de ampliación del microscópio.

La base y el brazo del microscópio deben suministrar una rígida estructura de soporte para la platina y el cuerpo de forma a resistir a la vibraciones normales presentes en un laboratorio.

Los principales requisitos del sistema mecánico de la platina son:

  1. Carga y descarga fácil (con el mínimo de manipulación o daño)
  2. Movimientos ortogonales precisos en los ejes x y y
  3. Folga mínima en los engranajes
  4. Necesidad de acoplamiento entre los movimientos en las direcciones x y y.

Además de la estabilidad mecánica, el microscópio debe tener en cuenta los patrones de ergonomia establecidos para que el usuario de ese equipamiento se sienta confortável al realizar la observación, principalmente si esta exija mayor dispêndio de tiempo.

Sistema de focagem [8]

Este sistema sirve para obtener imágenes nítidas del objeto que se está observando.

Forman parte de este sistema los pernos macrométrico y micrométrico, siendo a través de ellos que se procede a la focagem.

Sistema de ampliación [8][9][10]

El sistema de ampliación sirve para aumentar la imagen observada. La consecução de este objetivo es posible a través de las oculares y objetivas, que son sistemas de lentes convergentes.

Archivo:Constitución del microscópio de fluorescência1.jpg
Fig.2 Constitución del microscópio de fluorescência

Existen varios tipos de oculares debiéndose optar por aquella que más se adequa al trabajo pretendido. Las de Huygens , por ejemplo, tienen como principales características la simplicidade de construcción, bajo coste y desempeño adecuado para muchas aplicaciones. Poseen una cobertura de campo limitada y una pequeña tensión de relaxamento, que es la propiedad que la lente posee de evitar el cansancio de la visión en observaciones muy largas.

Otros tipos de oculares son las Hi-Point, que ofrecen la ventaja de tensión de relaxamento mayor (bueno para quien usa óculos) y posee la desvantagem de tener la cobertura de campo limitada. Las Widefield ofrecen mayor cobertura de campo del que cualquier otra ocular y ofrece una tensión de relaxamento igual a la Hi-Point. Ya las Hyperplane Compensating evitan la aberração cromática lateral, es decir, distorções de los colores en la parte periférica del campo de observación, que es común en las otras oculares y las Ultraplane son usadas específicamente para aplicaciones fotográficas.

En lo que concierne a la objetivas, una vez que la autofluorescência de iluminación de campo claro es peligrosa para el ser vivo, las estas deben ser escogidas cuidadosamente, siendo que en microscopia de fluorescência sólo las objetivas acromáticas simples son prácticas.

Con iluminación de fondo oscuro, el abanico de objetivas passíveis de ser escogidas es mayor, siendo posible optar por lentes más elaboradas, con mayor apertura y mayor “poder de recoja de luz”.

Sistema de iluminación [8]

El sistema de iluminación sirve para suministrar la luz necesaria a la formación de la imagen y consiste en: fuente de luz, filtros, condensador y diafragma de campo.

Este microscópio posee el sistema de iluminación de fluorescência situado por encima del plan de la muestra.

Fuente de luz [10]

Todas las fuentes de luz emiten un amplio rango de larguras de onda, incluyendo ultravioleta (UV) y luz visible azul, que son las larguras de onda de interés en la microscopia de fluorescência. Sin embargo, sólo algunas fuentes de luz son adecuadas, en la medida en que emiten luz de ondas suficientemente bajas para uso práctico.

Usualmente se usan lâmpadas de gas el alta presión, como las lâmpadas de vapor de mercúrio o las lâmpadas de gas xénon. Para la excitación de algunas larguras de onda, en el rango de la luz visible azul la verde, pueden aún ser usadas, por ejemplo, lâmpadas con filamentos de halogéneo, pues producen luz útil suficiente.

La elección de la fuente de luz adecuada depende del tipo de trabajo realizado y para observaciones corrientes es preferible usarse las lâmpadas de mercúrio como fuente de luz, siendo que estas operan con corriente alterna y son más baratas. Ya las lâmpadas de xénon operan con corriente directa y requieren la adición de rectificadores al equipamiento primario, si usadas en alimentación normal. Con alimentación DC (corriente continua) pueden ser estabilizadas, siendo entonces adecuadas para fluorimetria o medição de emisión de fluorescência.

Ambos tipos de lâmpadas difieren en sus curvas de emisión. Las lâmpadas de mercúrio, por ejemplo, alcanzan amplitudes elevadas para determinados larguras de onda, mientras que noutros la emisión es baja, lo que resulta en un perfil de emisión con varios picos. Las lâmpadas de xénon presentan un perfil más suave, con predominância de curvas continuas. Fortuitamente, los picos en la emisión por vapor de mercúrio coinciden con las larguras de onda de excitación de gran parte de los fluorocromos más usados.

Teniendo en cuenta que estas fuentes de luz contiene gas la elevada presión, ellas tienen que ser manuseadas con gran cuidado y alojadas en estructuras fuertes y con protección, siendo que será aquí que se filtrarán el calor y emisión de infrarrojos antes de la luz provinda de la fuente iniciar su trayecto hasta a la muestra.

Estas lâmpadas poseen aún tiempos de vida específicos, siendo, por ejemplo, en el caso de las de mercúrio de aproximadamente 200 horas. Cuando usadas para periodos de tiempo superiores, puede resultar en una destrucción de la lâmpada con explosión de esta y subsequente liberación del vapor de mercúrio en las imediações del microscópio.

Los últimos años, un nuevo tipo de fuente de luz ha sido introducido, denominado de díodo de emisión de luz (LED). Este es un aparato semicondutor de tipo estado sólido.

Los LEDs poseen periodos de vida muy largos, con pocas alteraciones en la salida de luz al inmediatamente del tiempo de vida. Otra característica es que estas fuentes de luz emiten en una largura de onda sólo, con una anchura del pico muy estrecha, lo que hace con que su uso haya aumentado al nivel de la microscopia. A pesar de no ser tan intensas cómo las de alta presión, estas no requieren tantos filtros ópticos para seleccionar la largura de onda de interés y no sufren las distorções de luz visualizadas en las de alta presión. Además de esto, no existe el peligro de explotar.

Sin embargo, para emisión la diferentes larguras de onda, serán necesarios diferentes LEDs, no siendo también necesario seleccionar un nuevo conjunto de filtros de emisión, pues cada LED emite en bandas muy estrechas y sólo en una largura de onda.

Filtros [11]

Existen 3 grandes categorías de filtros: filtros de excitación (excitadores), filtros de barrera (emisión) y filtros separadores de rayos dicromáticos o espejos dicromáticos.

Los filtros para fluorescência, inicialmente, fueron construidos exclusivamente a partir de vidrio corado o una “mezcla” de gelatina entre dos vidrios. Pero, actualmente se fabrican vidrios de alta resolución con ópticas de interferencia, en los filtros de excitación para que permitan o rechacen el pasaje de luz a determinados larguras de onda con grande especificidade y elevada transmisión.

Los espejos dicromáticos son filtros de interferencia especializados, diseñados para reflectir o permitir el pasaje de la luz a específicas larguras de onda, cuando colocados en el trayecto de la luz con una inclinación de 45º.

Los filtros de barrera son fabricados con ambos vidrios corados o con revestimiento de interferencia (o una combinación de los dos).

Tipo de filtro
Abreviaturas
Significado
Filtros de excitación UG Ultraviolet glass
BG Blue glass
KP o SP Shortpass filters
IF Interference filters: filtros buenos en situaciones con bajo Stoke’s shift
Filtros de barrera (si asociado con número, este es referente a la largura de onda) LP o L Longpass filters
Y o GG Yellow glass
R o DNI Red glass
Lo u OG Orange glass
K Kante (término alemán para bordo – filtro de bordo)
BA Filtro de barrera
Filtros dicróicos separadores de feixes CBS Chromatic beam splitter
RKP Reflection short pass

Condensador [10]

Los condensadores de campo claro están aptos a iluminar el objeto usando toda la energía disponible, sin embargo, estos también direccionan los rayos tras el objeto hasta a la objetiva. Esto constituye, no sólo un potencial peligro para los ojos del observador, como puede también establecer una perturbação en la forma como los componentes de la objetiva reciben la autofluorescência. Como consecuencia, la mayoría de los sistemas adoptó el condensador de campo oscuro que no permite la entrada de luz directa en la objetiva , y adicionalmente, proporcionará un fondo oscuro que contraste con la fluorescência.

La emisión de luz fluorescente es, en la mayoría de los casos, muy pobre relativamente a la cantidad de energía absorbida por los fluorocromos o fluoróforos, con un ratio de eficacia comprendido entre 1:1000 y 1:100 (el mejor), de modo que cualquier sistema que reduzca la energía disponible para cualquier medida debe ser bien considerada antes de su utilización.

Diafragma [7]

El diafragma se sitúa junto al condensador y es el responsable pelo controlo de la apertura angular del cono de luz para la iluminación de la muestra.

Principios Físicos de Funcionamiento

Principio General [6]

Archivo:Principio de la emisión de fluorescência.png
Fig.3 Principio de la emisión de fluorescência

La microscopia de fluorescência asienta en el siguiente fenómeno:

  1. Energía es absorbida por el átomo, que queda excitado;
  2. El electrón, después de absorber energía, orbita para un nivel energético superior;
  3. El electrón retorna a su estado inicial emitiendo un fóton.

De esta forma, la tarea fulcral del microscópio de fluorescência consiste en permitir que la luz de excitación irradie la muestra y después separar la luz emitida más débil para formar la imagen. Así, primero, la luz, originária de la fuente de luz colocada en un extremo del microscópio, se encuentra frente a un filtro de excitación que sólo va a dejar pasar la radiação con la largura de onda deseado, siendo este coincidente con el material fluorescente. La radiação después pasa por el espejo dicromático, que hace con que ruede 45º colidindo entonces con los átomos de la muestra, lo que lleva a que los electrões sean excitados para un nivel energético superior. Cuando estos átomos pierden la energía de excitación, retoman el nivel energético de reposo y emiten luz (fotões).

Para hacerse visible, la luz emitida hace a pasar por el espejo dicromático siendo después separada de la luz de excitación (absorção) más brillante en un filtro de barrera. Aquí, el hecho de la luz emitida tener energía más baja y una mayor largura de onda es usado para permitir la criba. Las áreas fluorescentes son entonces exhibidas y se podrán observar en el microscópio, evidenciadas contra un fondo oscuro de alto contraste.

Desvío de Stokes [12]

Archivo:Desvío de Stokes.png
Fig.5 Desvío de Stokes

El desvío de Stokes corresponde a la diferencia (de largura de onda o unidades de frecuencia) entre las posiciones en el espectro de los puntos máximos de las bandas de absorção y emisión de fluorescência para la misma transición electrónica.

Generalmente, la emisión de fluorescência va a ocurrir a una largura de onda superior al de absorção de la misma. Sin embargo, si el fenómeno contrario se verifique es denominado por desvío anti-Stokes.

A medida que el desvío de Stokes aumenta, se hace más fácil separar luz de excitación de la de emisión a través del uso de combinaciones de los filtros.

Fenómenos de fading, quenching, photobleaching [11]

Existen un ancho espectro de condiciones que regularmente surgen y afectan las radiações de la emisión de fluorescência y van a reducir su intensidad. El término general para la reducción de la intensidad de emisión de fluorescência es fading (desvanecimento), siendo este subdividido en fenómenos de quenching (extinción) y photobleaching (lixiviamento/branquemento).

El photobleaching corresponde a la decomposição irreversível de las moléculas fluorescentes en su estado excitado debido a la interacción de estas moléculas con oxígeno molecular antes de emitir energía. La ocurrencia del photobleaching es explorada en una técnica conocida por recuperación de fluorescência después de photobleaching (FRAP – fluorescence recovery after photobleaching). El método se basa en el branqueamento de una región bien definida de la muestra debido a una intensa explosión de luz láser, acompañada por una subsequente observación de las tasas y patrones de la recuperación de fluorescência en las áreas branqueadas. Una técnica relacionada, denominada pérdida de fluorescência en photobleaching (FLIP – fluorescence loss in photobleaching) es utilizada para monitorizar el decréscimo de fluorescência en una determinada región adyacente al área branqueada.

El proceso de relaxamento después de estado excitatório, en el quenching, resulta en una reducción de la intensidad de fluorescência a través de una variedad de mecanismos que envuelven pérdida de energía no radioactiva y frecuentemente ocurre como resultados de agentes oxidantes o de la presencia de sales, metales pesados o compuestos de halogéneo. En algunos casos, el quenching resulta de la transmisión de energía para otra molécula (denominada aceitador) físicamente próxima del fluoróforo excitado (el dador), siendo este fenómeno conocido por resonancia de energía transferida en fluorescência (FRET – fluorescence resonance energy transfer).

Variación de la luz fluorescente [11]

La emisión de fluorescência que resulta del flujo de luz depende de la absorção y emisión características del fluoróforo usado, de la concentración de este en la muestra y de la largura del recorrido óptico de la muestra. En términos matemáticos, la fluorescência producida (F) es dada por la ecuación:

F = σ x Q x I

donde σ corresponde a la absorção molecular del tejido, Q es el rendimiento quântico, e I corresponde al flujo de luz incidente.

Partiendo de esta ecuación surge la cuestión de cuantos fotões emitidos serían detectados y por cuánto tiempo continuaría la tasa de emisión.

La eficiencia de detección es dada en función de la eficiencia del conjunto óptico usado y de la eficiencia del detector quântico.

Ya la duración de emisión de fluorescência depende de la tasa de destrucción de fluoróforo como resultado del photobleaching. Una forma de prolongar el periodo de observación es reduciendo la intensidad del flujo de luz incidente, para que sólo una pequeña fracción de las moléculas de fluoróforo en la solución de coloração son excitadas y subsiguientemente fotodestruídas.

Procesamiento de muestras [5][13][14]

La preparación de muestras para microscopia de fluorescência es, de una forma general, semejante a la preparación de las muestras para los restantes tipos de microscópio. Pero, existen algunos aspectos que deben ser tomados en consideración para la obtención de buenos resultados. De ressalvar que es importante evitar usar reagentes o materiales que sean fluorescentes o que puedan estar contaminados con materiales fluorescentes.

La técnica de preparación de las muestras depende esencialmente del tipo de material. El material biológico es generalmente seccionado, en secciones muy finas (en la orden de las 3μm) que son colocadas en cuchillas.

Las muestras también pueden ser utilizadas en forma de esfregaço (por ejemplo de sangre, células esfoliadas, colonias de bacterias). Este tipo de material es colocado en cuchilla y después fijado.

Más allá de este tipo de procesamiento, la microscopia de fluorescência también puede ser aplicada la células vivas, por ejemplo, para determinar la concentración intracelular de iões de Ca2+ y H+, de forma a monitorizar el pH de las células vivas.

El estudio en células vivas requiere algunas condiciones especiales. Por ejemplo para el estudio de la fluorescência de NADH en la capa superficial de tejidos vivos, es necesario mantener la muestra en una caja cerrada con una atmósfera controlada que prevenga la oxidação de la NADH por el oxígeno atmosférico.

A pesar de existir múltiples técnicas para la preparación de las muestras, de más utilizada consiste en la cosecha del tejido, fijación, procesamiento, inclusión, corte y coloração.

Fijación [5][15]

Después de su remoção del organismo, los tejidos deben ser fijados el más rápidamente posible, para evitar la digestão de los tejidos por enzimas presentes en el interior de las células (autólise) o por bacterias (putrefacção), preservando así su estructura y la composición molecular.

La fijación podrá afectar la fluorescência del tejido. Fixadores como el formol y el ácido acético pueden inducir la fluorescência en ciertas substancias. El glutaraldeído produce fluorescência de fondo intensa.

Procesamiento [16]

El procesamiento es constituido por las siguientes etapas:

  1. Desidratação – remoção de toda el agua existente en los tejidos, a través de sucesivos baños de un agente desidratante. Las soluciones más usadas son alcoholes de concentración creciente.
  2. Diafanização o clarificação – sustitución del agente desidratante por una substancia que sea simultáneamente miscível en agua y en medio de inclusión.
  3. Impregnação – preenchimento de los espacios tecidulares, que inicialmente contenían agua, por substancia hidrofóba. Habitualmente, este producto será también el medio de inclusión.

Inclusión [16]

La inclusión coloca las muestras en un medio de soporte, para que los tejidos adquieran una consistencia que permita la obtención de cortes finos, que puedan ser observados al microscópio óptico.

Corte [15]

Después de la inclusión, las muestras en medio de soporte (bloques) son seccionadas en un micrótomo de modo a obtener cortes de 1-10 μm de espesor.

Marcación [15]

Para sea posible el estudio de los cortes histológicos estos tienen que ser corados, una vez que, salvo raras excepciones, la mayoría de los tejidos es incolor.

Para la microscopia de fluorescência son utilizados fluorocromos para observar las estructuras pretendidas. Los fluorocromos utilizados son moléculas fluorescentes con afinidade por moléculas presentes en las células que son utilizadas como corantes fluorescentes.

Montaje [5]

El montaje asume especial importancia en la microscopia de fluorescência. El medio de montaje, una vez que está en contacto con el fluorocromo, no podrá causar su disolución u obscurecimento.

El medio de montaje para microscopia de fluorescência debe llenar algunos requisitos específicos. Así siendo, este debe ser transparente a cualquier largura de onda, no ser fluorescente, su índice de refracção debe ser igual al de la lamela, no debe disolver muestra en general y el fluorocromo en particular, debe suministrar un ambiente propicio al fluorocromo, que maximice su fluorescência y evite reacciones que lleven a su atenuación.

Aplicaciones [10][17]

La técnica de microscopia de fluorescência se ha hecho una herramienta esencial en la Biología y en las Ciencias Biomédicas así como en las Ciencias de los Materiales debido a sus atributos.

La utilización de fluorocromos hizo posible la identificación de células y de componentes celulares sub-microscópicos con un elevado grado de especificidade entre el material no fluorescente. De hecho, el microscópio de fluorescência es capaz de revelar la presencia de una única molécula. Más allá de eso, este permite que a través de técnicas de fluorescência múltiple puedan ser identificadas, simultáneamente, varias moléculas blanco.

Las proteínas fluorescentes son aplicadas para la determinación de la localización y dinámica de proteínas, organitos y otros compartimientos celulares, e incluso para evaluar la capacidad de expresión de diversos fiscales. Para estos estudios son utilizadas muestras coradas con corantes fluorescentes (de una forma general, el isiotiocianato de fluoresceína) o muestras de substancias que emiten luz de forma natural, cuando expuestas a la luz ultravioleta o azul.

Las características de este microscópio, así como su especificidade confieren a sus técnicas particular utilidad en la exibição de estructuras y medição de eventos fisiológicos y bioquímicos en las células vivas. Particularmente, la existencia de múltiples indicadores fluorescentes contribuye para el estudio de una multiplicidade de productos químicos fisiológicamente importantes como ADN, cálcio, magnesio, sódio, pH y enzimas.

A través de la imunofluorescência, con recurso a anticorpos específicos, puede visualizarse la presencia de las substancias pretendidas, partiendo de la combinación de anticorpos específicos de varias moléculas biológicas, químicamente conectados a la moléculas fluorescentes, resultando en la marcación de estructuras específicas dentro de las células.

De este modo, las aplicaciones de la microscopia de fluorescência son varias permitiendo ámbitos de estudio distinguidos. Algunos de los ejemplos más proeminentes son la investigación de organitos celulares, el estudio de reacciones enzimáticas, análisis de viabilidade celular y de función celular, como fenómenos de endocitose , exocitose, transdução de señales, potenciales de membrana, entre otros.

FRAP [18][19]

En el estudio funcional de macromoléculas, tales como de fenómenos de difusión, asociación y dissociação, se aplica un método denominado por FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching).

Este método consiste en proyectar una luz de gran intensidad para que un fluorocromo pierda la capacidad de emitir fluorescência, pudiendo así medir el movimiento al largo del tiempo de la molécula de interés (por ejemplo proteína, lípido o hidrato de carbono), siendo que esta se encuentra covalentemente conectada a un otro fluorocromo, diferente del que sufrió photobleaching.

Esta técnica fue usada para ayudar a definir la plantilla del mosaico fluido de la membrana celular.

FRET [19][20]

La realización de experiencias que envuelven moléculas adyacentes puede ser realizadas por el método de FRET (Fluorescence/ Förster Ressonance Energy Transfer).

Esta técnica permite demostrar la distancia entre una molécula aceitadora y una receptora debido a la existencia de conexiones dipolo-dipolo.

Cuando la molécula dadora se encuentra de más de 10 nm de distancia de la molécula receptora, habrá poca interacción entre ellas y la molécula dadora emitirá fotões después de su excitación con el láser. Sin embargo, si las moléculas se encuentren a una distancia inferior a 10 nm la molécula aceitadora recibirá energía de la molécula dadora y va a emitir fotões con un color diferente.

La eficacia de la transferencia de energía dependerá de la distancia entre el aceitador y el dador, del grado de solapamiento espectral entre el espectro de emisión del dador y el espectro de absorção del aceitador y de la relativa orientación paralela de los dipolos del aceitador y del dador.

También permite la realización de estudios de iões y moléculas metálicas o sobre la distribución y dinamismo intracelular de macromoléculas.

Ventajas y limitaciones

Ventajas [13][16]

  1. Permite el estudio y la observación de células vivas
  2. Como sólo la luz reflectida es observada, mientras la transmitida es eliminada del campo de visión, crea mayor intensidad y la definición de la imagen es superior.

Limitaciones [21]

  1. Preparaciones no permanentes, la técnica de fluorescência va decaindo, o sea, al fin de algún tiempo de permanencia del fluorocromo en las células, su efecto desaparece.
  2. Observación de las preparaciones tiene que ser efectuada en sala oscura, debido a la débil adaptación del ojo humano al oscuro, podrá ser difícil la observación de muestras durante algún tiempo después del escurecimento de la sala.

Galeria de imágenes

Archivo:Marcación por imunofluorescência1.jpg
Fig.6 Marcación por fluorescência (rojo - actina; verde - microtúbulos; azul – núcleo)
Archivo:Doble marcación de imunofluorescência1.jpg
Fig.7 Doble marcación de imunofluorescência
Archivo:Dos núcleos celulares y cromossomas en metafase1.png
Fig.8 Dos núcleos celulares (izquierda y derecha) y cromossomas en metáfase - secuencias específicas del ADN son marcadas en rojo y verde
Archivo:División de una célula del ovário de un hamster chino1.png
Fig.9 Tripla fluorescência de la división de una célula del ovário de un hamster chino
Archivo:Porción de hueso visualizada en microscopia de fluorescência1.png
Fig.10 Porción de hueso visualizada en microscopia de fluorescência
Archivo:Doble marcación de Fluorescência de células de mamíferos1.png
Fig.11 Doble marcación de Fluorescência (ADN en el núcleo de las células – azul; microfilamentos citoplasmáticos – verde
Archivo:Fibroblastos.jpg
Fig.12 Fibroblastos (azul - F-actina; rojo – mitocôndrias)
Archivo:Melanócito 1.jpg
Fig.13 Melanócito visto en imagen de microscopia de fluorescência. Los melanossomas y los organelos celulares que transportan la melanina, están indicados la verde.

Referencias bibliográficas

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